カルメン(アレクサ・ヴェガ)&ジュニ(ダリル・サバラ)姉妹は、前回の騒動のお手柄によって、OSSと呼ばれる戦略事務局に正式に設置されたスパイ・キッズ部門のレベル2に認定されている。しかしライバルのスパイキッズ、ゲイリー(マシュウ・オリアリー)とガーティ(エミリー・オズメント)のギグルズ兄妹が彼らの任務をことごとく邪魔し、自分たちの手柄にしたものだから、カルメンとジュニは名誉挽回の活躍をしなければならないことに。また、彼らの父親グレゴリオ(アントニオ・バンデラス)と、ギグルズ兄妹の父親ダナゴン(マイク・ジャッジ)が、OSS次期局長をめぐって対決。そんな中、ダナゴンは、ドクター・ロメロ(スティーヴ・ブシェミ)が誤って作った異常な巨大動物たちの島を覆い隠す装置トランスムッカーを手に入れようと狙っていた……。